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流式細(xì)胞術(shù)檢測稀少細(xì)胞

稀有細(xì)胞,其單獨(dú)存在或在相對(duì)低數(shù)量的細(xì)胞混合物中存在,通常指示健康狀態(tài)。細(xì)胞存在于它們通常不存在的地方,例如循環(huán)血液中的內(nèi)皮細(xì)胞,表明存在嚴(yán)重的病理。

流式細(xì)胞儀在發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞和理解它們?nèi)绾闻c更豐富的細(xì)胞不同方面發(fā)揮了重要作用。MilliporeSigma(Billerica,MA)的流式細(xì)胞儀成像產(chǎn)品經(jīng)理Sherree Friend博士說:“在過去,顯微鏡是要走的路,但這種技術(shù)需要一個(gè)訓(xùn)練有素的操作員長時(shí)間掃描視野??紤]到觀察和人類耐力的限制,檢測足以用于稀有細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證的細(xì)胞數(shù)量變得困難。

顯微鏡仍然用于表征通過流動(dòng)方法分離的稀有細(xì)胞?;诩?xì)胞的形態(tài)學(xué)評(píng)估,使用事件和分子特異性熒光標(biāo)簽,通常涉及細(xì)胞儀下游的附加步驟和儀器。MilliporeSigma的Amnis®成像流式細(xì)胞儀結(jié)合了這些關(guān)鍵的分析功能。

在一個(gè)應(yīng)用中,來自布法羅大學(xué)(NY)的研究人員通過定量外周血T淋巴細(xì)胞中NF-kB的易位程度來研究器官移植患者的免疫抑制水平。研究者得出結(jié)論,通過成像流式細(xì)胞術(shù)獲得的數(shù)據(jù)可以幫助指導(dǎo)移植患者中免疫抑制藥物的適當(dāng)劑量水平。盡管細(xì)胞和蛋白質(zhì)在技術(shù)上都不是“罕見的”,但是這說明了可以進(jìn)行細(xì)胞分析的細(xì)節(jié)。

在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,來自加拿大衛(wèi)生部的研究人員開發(fā)了一種檢測罕見的雙核細(xì)胞以定量微核的測定法,目前通過顯微鏡進(jìn)行的過程。研究者得出結(jié)論,成像流式細(xì)胞術(shù)可以提供一種更快速和更準(zhǔn)確的方法來估計(jì)來自意外輻射暴露的未知輻射劑量。

結(jié)合顯微鏡和細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)提出了關(guān)于罕見細(xì)胞事件的一個(gè)有趣的觀點(diǎn)。朋友解釋說,“當(dāng)觀察它們時(shí),研究人員經(jīng)常擔(dān)心人為因素 - 例如顆粒粘在細(xì)胞上。將成像與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合提供了額外的能力來驗(yàn)證罕見事件不是假的,特別是當(dāng)您沒有數(shù)千個(gè)細(xì)胞或事件時(shí)。它允許您同時(shí)識(shí)別細(xì)胞形態(tài)和發(fā)生。

速度和數(shù)字很重要

從臨床角度來看,罕見細(xì)胞計(jì)數(shù)事件的分析有時(shí)可以檢測“**小殘留病變”(MRD),當(dāng)某些疾病似乎被根除但是在非?;镜乃綍r(shí),不發(fā)生。在為白血病或淋巴瘤治療的患者中討論MRD是常見的,其中血常常是正常的,并且患者感覺良好,但它們**終復(fù)發(fā)并因其疾病死亡。

常規(guī)診斷不能檢測指示**終復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)MRD水平。

評(píng)估實(shí)體瘤中的MRD是困難的,因?yàn)榧?xì)胞附著在異質(zhì)組織內(nèi)。血癌更加“診斷友好”,因?yàn)槲kU(xiǎn)因子可以作為單一的低豐度細(xì)胞檢測到。

MRD相關(guān)細(xì)胞發(fā)生在100,000以下的水平,被認(rèn)為不可能在患者的正常壽命內(nèi)引起復(fù)發(fā)。“Beckman Coulter(邁阿密,佛羅里達(dá)州)科學(xué)事務(wù)總監(jiān)Jeannine Holden博士說,”但是你不能知道樣品中的濃度是否相關(guān)。診斷師必須計(jì)數(shù)足夠的細(xì)胞以確認(rèn)觀察結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的,這可能涉及數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

計(jì)數(shù)許多離散實(shí)體,即使在流式細(xì)胞術(shù)速度,是昂貴和耗時(shí)的。

在樣品制備期間損失了大量的細(xì)胞,并且靶細(xì)胞群體的富集并不總是實(shí)用的。“你正在研究混合10到20種細(xì)胞類型,彼此沒有很大的不同,”霍爾頓告訴實(shí)驗(yàn)室經(jīng)理。挑出靶細(xì)胞需要觀察盡可能多的參數(shù)或顏色。顏色是指來自不同標(biāo)簽的熒光發(fā)射。骨髓瘤血液樣品含有惡性和正常B細(xì)胞??,成熟和不成熟。

疾病相關(guān)的細(xì)胞可以在治療過程中改變。在診斷中占優(yōu)勢的細(xì)胞通常不同于治療期間或長期緩解期后臨床醫(yī)生感興趣的細(xì)胞。此外,生物藥物可以對(duì)腫瘤細(xì)胞群體施加選擇壓力。“如果沒有表達(dá)CD20表面抗原的細(xì)胞亞群逃避抽取,他們可能會(huì)在以后出現(xiàn),”霍爾頓說。“此外,細(xì)胞可能經(jīng)歷表型漂移。

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研究人員使用細(xì)胞分選或細(xì)胞分析儀來表征和分離純的細(xì)胞亞群,其通常是具有0.01%和更低的頻率的稀有細(xì)胞。除了挑戰(zhàn)之外,起始樣品(例如,原代細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的可用性通常有限。在血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞是液體活檢的基礎(chǔ),其將基于細(xì)胞的診斷超越簡單的形態(tài)學(xué)表征到蛋白質(zhì)和基因水平。**認(rèn)為,液體活檢可能有**會(huì)取代許多固體組織活檢。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是相當(dāng)罕見的,我們對(duì)其意義的理解是有限的,但沒有流式細(xì)胞術(shù),液體活檢將是不可能的。

Bio-Rad(Hercules,CA)**產(chǎn)品經(jīng)理Nicole Ovadia表示:“高參數(shù)實(shí)驗(yàn)是稀有細(xì)胞深度分析的關(guān)鍵。這里術(shù)語參數(shù)和顏色 - 可用的熒光頻率 - 是可互換的。超快速檢測允許細(xì)胞儀拾取幾種顏色,代表不同的事件,同時(shí)單個(gè)細(xì)胞拉鏈。

多年來,流式細(xì)胞術(shù)被困在十種或更少顏色的范圍內(nèi)。Bio-Rad**近推出了ZE5™細(xì)胞分析儀,可以檢測28種顏色和高達(dá)100,000次事件或細(xì)胞每秒,而不會(huì)丟失數(shù)據(jù)。“這意味著檢測更多的參數(shù),并且比常規(guī)流動(dòng)方法更快速,”Ovadia告訴實(shí)驗(yàn)室經(jīng)理。通過流式細(xì)胞術(shù)的**細(xì)胞分析正在推進(jìn)通過儀器和檢測試劑的創(chuàng)新,主要由在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記抗體組成。“一旦平臺(tái)存在,試劑和工具就會(huì)隨之改進(jìn),”MilliporeSigma的朋友說。同時(shí)檢測RNA和蛋白質(zhì)共定位,流式細(xì)胞術(shù)的相對(duì)新的能力,提供對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的見解。常規(guī)基于細(xì)胞的測定法(例如FISH)的適應(yīng)性增強(qiáng)更窄集中的檢測方法。有了這種類型的“開發(fā)”,流式細(xì)胞術(shù)檢測稀有細(xì)胞和相關(guān)事件的效用繼續(xù)改善,即使儀器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的狀態(tài)。